BCA蛋白定量检测试剂盒

关联信息

BCA蛋白质定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit）是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法中的BCA（bicinchoninic acid，二喹啉甲酸）法研制而成，其基本原理是蛋白质分子中的肽键结构在碱性环境下能与Cu2+ 生成络合物，并将Cu2+还原成Cu+，BCA试剂会灵敏的与Cu+结合，形成稳定有颜色的复合物，并在562 nm 处有最大光吸收值，这样通过判断反应混合液颜色的深浅便能测定蛋白含量。该检测试剂盒能对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定，检测浓度下限最低达到20µg/ml，并在50-2000µg/ml浓度范围内有较好的线性关系。

试剂盒组分

储存及有效期

BCA试剂A、BCA试剂B室温保存；BSA 标准品-20℃保存。试剂盒质保期一年。
注：如果在寒冷天气进行运输，或在保存期间，试剂 A 或试剂 B 发生沉淀，可通过对溶液进行温和加热和搅拌，使沉淀溶解。当试剂盒发生变色或证明有微生物污染时，请将试剂丢弃。

样本处理

1、将样品的浓度稀释或者浓缩到试剂盒的检测范围20-2,000μg/ml。
2、样品中的干扰物质不能含有或者超过额定量（详细见附表）。
3、样品中干扰物质的处理方法：
1)  通过透析或凝胶过滤来除去干扰物质；
2)  对样品进行稀释，直到该物质不再产生干扰为止。只有当起始蛋白质浓度足够高，在稀释以后，其浓度仍能保持在定量分析的范围内时，这种方法才有效；
3)  用丙酮或三氯乙酸（TCA）沉淀样品中的蛋白质。将含有干扰物质的液体成分丢弃，蛋白质沉淀可复溶于超纯水中，或直接溶解在碱性 BCA 工作液中；
4)  增加工作液中铜离子的含量（试剂 A 与试剂 B 的以 50:2 或 50:3 的比例混合制备工作液），这种方法可以消除铜螯合剂导致的干扰。
注：为了获得最高的准确度，必须对蛋白质标准物质和待测样品进行相同的处理。

试剂准备

1、标准品稀释
按照下表制备一组蛋白质标准品。向1瓶牛血清白蛋白标准品（BSA）中加入1 ml缓冲液，成为2mg/ml标准品，最好使用与待测样品相同的缓冲液。每一支2 mg/ml 牛血清白蛋白标准品足够用于制备下表中所列出的任意一组稀释范围的标准品；每个稀释浓度的标准品的体积足够用于3次重复检测。    
   用于标准方案的稀释方法如下：
 

2、按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀，现配现用。

操作步骤

1、将样品和标准品稀释液按25μl/孔的要求，分别加入96T板的板孔内；
2、各孔加入200µl BCA 工作液，置于水平摇床轻轻震荡混匀，37℃放置30分钟；
3、将96孔板冷却至室温，用酶标仪测定A562吸光度（如果没有该波长，540nm-595nm之间的任意波长均可测定）
4、根据标准溶液吸光值和浓度制作标准曲线，计算待测样品浓度(使用与酶标板相关联的曲线拟合算法，二次方程等曲线拟合将会比简单的线性拟合提供更加准确的结果。如果手工对这些结果作图，对于标准曲线上的各个点，采取点对点描画曲线的方法，比直接进行线性拟合的结果更好)

注意事项

1、标准曲线的线性范围为20-2,000μg/ml。
2、样品中各干扰检测的物质含量需低于临界值。
3、BCA工作液现配现用。

问题及解决方案